实验准备
1. 样本准备：细胞爬片、组织切片或其他生物样本。样本需保持活性和结构完整，若是组织切片，需提前固定、脱水、包埋和切片；细胞爬片则在合适培养条件下生长至合适密度。
2. 试剂：PBS缓冲液、4%多聚甲醛固定液、0.1% Triton X-100通透液（用于细胞样本）、5% BSA封闭液、一抗（针对目标蛋白，按合适比例用抗体稀释液稀释）、荧光标记二抗（对应一抗宿主物种，按推荐比例稀释）、DAPI染液（用于染细胞核）、抗荧光淬灭封片剂。

样本处理
1. 固定：将细胞爬片或组织切片放入4%多聚甲醛中，室温固定15 - 20分钟。固定目的是保持细胞和组织形态结构，防止抗原降解。
2. 清洗：固定后用PBS缓冲液清洗样本3次，每次5分钟，去除残留固定液 。
3. 通透（针对细胞样本）：细胞样本用0.1% Triton X-100室温孵育10分钟，使细胞膜通透性增加，利于抗体进入细胞与抗原结合。之后再用PBS洗3次，每次5分钟。组织样本一般无需此步，除非目标抗原在细胞内且难以被抗体接触。

封闭与抗体孵育
1. 封闭：将样本置于5% BSA封闭液中，室温孵育30 - 60分钟，封闭非特异性结合位点，减少背景染色。
2. 一抗孵育：倒掉封闭液，不洗，直接滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜或37℃孵育1 - 2小时。低温长时间孵育可增强抗体与抗原结合特异性和灵敏度。
3. 清洗：用PBS缓冲液清洗样本3次，每次5 - 10分钟，充分洗去未结合一抗 。
4. 二抗孵育：滴加荧光标记二抗，室温避光孵育30 - 60分钟。二抗可特异性结合一抗，且携带荧光基团用于后续检测。注意需避光，防止荧光淬灭。
5. 清洗：再次用PBS缓冲液避光清洗样本3次，每次5 - 10分钟，洗去未结合二抗。

细胞核染色与封片
1. 细胞核染色：滴加适量DAPI染液，室温避光孵育5 - 10分钟，对细胞核进行染色。DAPI能与双链DNA结合，在紫外光激发下发出蓝色荧光。
2. 清洗：用PBS缓冲液避光清洗1 - 2次，每次5分钟，洗去多余DAPI染液。
3. 封片：在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将样本（细胞爬片或组织切片面朝下）置于封片剂上，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。封片剂可防止荧光淬灭，利于长期保存和观察。

观察与分析
1. 观察：将封好的样本置于荧光显微镜下，选择合适激发光和发射光滤光片，分别观察并采集目标蛋白荧光信号和细胞核DAPI荧光信号，拍照记录。

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