细胞加药是做实验经常遇到的问题， 但其实只需掌握以下5个步骤，就能轻松搞定！
一、明确实验目的
首先，需要明确研究目标，因为这决定了实验的浓度选择策略
1.药物类型：
小分子抑制剂剂：通常需要找到其有效作用浓度（如IC50，EC50）
细胞因子/生长因子：通常参考文献中使用浓度，在ng/mL或pg/mL级别
中药提取物/天然产物：由于成分复杂，通常需要从较高浓度开始摸索，并设置严格的溶剂对照组
siRNA/miRNA（转染）：浓度通常以nM为单位，需要优化转染试剂与核酸的比例
2.实验目的：
机制探索：需要找到能产生适度、可检测表型的浓度，而不是一味追求最大杀伤或激活
药效评估：需要精确计算半最大效应浓度（如IC50/EC50）
毒性测试：（低中高）需要设置一个浓度梯度
二、文献调研
在开始任何实验之前，充分的文献调研可以让安信娱乐事半功倍。
1.进行关键词搜索，在PubMed、Google Scholar等数据库搜索“药物名称+细胞系名称”，搜索过程中重点关注以下几个方面：
别人使用的浓度范围
处理时间
使用的溶剂（如DMSO、乙醇、PBS）及其最终浓度（尤其是DMSO，通常不能超过0.1%-0.5%，否则有溶剂毒性）
细胞的接种密度和培养时间
2.如果没有完全相同的文献：
查找该药物在同类细胞（如其他癌细胞、其他上皮细胞）中的使用浓度
查找该药物的临床血药浓度（Cmax），这可以为体外实验提供一个生理相关的参考起点
三、预实验确定大致浓度范围
1.设置一个宽的浓度梯度
建议设置如1nM，10nM，100nM，1μM，10uM，100uM 这样的对数浓度梯度
一定要设置空白对照组（只有细胞和培养基）和溶剂对照组（含有最高浓度的溶剂，如0.1%DMSO）
2.选择快速、可靠的检测方法
MTT/CCK-8法：快速检测细胞活力和增殖
显微镜观察:：直接观察细胞形态、密度、空泡化、脱落等变化
3.分析结果：
找到几乎无影响的浓度和几乎完全抑制/杀死细胞的浓度。这个范围就是你下一步进行精细梯度实验的基础
四、正式实验精确确定有效浓度
在预实验确定的大致范围内，设置一个更精细的浓度梯度（例如，8~10个浓度），进行正式实验，以精确计算关键参数
1.核心概念:
IC50（半抑制浓度）：抑制细胞活力、增殖或某种特定功能达到50%时的药物浓度。常用于抑制剂、化疗药
EC50（半最大效应浓度）：引起最大生物效应一半时的药物浓度。常用于激动剂、激活剂
2.实验与数据分析：
设置梯度与对照：在预实验确定的范围内设置更密集的浓度点（例如，从无明显效应到完全效应的区间内设8个点）。同样设置空白对照和溶剂对照
处理细胞与检测：用不同浓度药物处理细胞一定时间后，使用可靠的检测方法（如CCK-8 for活力，流式细胞术for凋亡，Western Blot for蛋白磷酸化水平等）收集数据
计算IC50/EC50
将实验数据（如OD值、荧光强度）归一化
对于抑制剂：抑制率（%）=【1-（实验组-空白对照）/（溶剂对照组-空白对照）】*100%
对于激活剂：激活率（%）=【（实验组-空白对照）/（溶剂对照组-空白对照）-1】*100%
使用专业软件进行曲线拟合和计算：GraphPad Prism（最常用），选择[Inhibitor]vs.response --Variable slope (fourparameters)等模型进行非线性回归拟合，lmageJ/SPSS/R语言等也具备类似功能，拟合出的S形曲线中点对应的浓度就是IC50或EC50
五、功能验证与时间梯度
找到IC50/EC50并不是终点，还需要验证在这个浓度下，是否能观察到预期的生物学效应
1.功能验证：使用计算出的IC50浓度及其上下1~2个浓度，进行下游功能实验（如划痕实验、Transwell实验、细胞周期检测、qPCR检测基因表达等），确认该浓度确实能引发想要的表型
2.时间梯度：药物的效应是时间依赖性的。可能需要设置不同的处理时间（如24h、48h、72h），观察效应随时间的变化
关键注意事项
1.溶剂毒性：始终牢记设置溶剂对照，并确保溶剂本身对细胞无影响
2.细胞状态：使用状态良好、对数生长期的细胞，传代次数不宜过多
3.药物稳定性：了解药物在培养基中是否稳定，是否需要更换含药培养基
4.无菌操作：配药和加药过程保证无菌，避免污染
5.重复实验：任何浓度的确定都需要至少3次独立的重复实验来保证结果的可靠性和可重复性。
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