众所周知，癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡，就可以很好的为肿瘤诊断提供重要指标。但是，流式检测细胞凋亡怎么做呢？实验过程中又有什么东西要特别注意呢？
Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，Annexin Ⅴ能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶可与DNA结合，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此，将Annexin V与PI联合使用时，就可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。
流式检测细胞凋亡的实验操作步骤如下：
1、收集细胞：取适量的对数生长期细胞接种于6孔板中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞（细胞凋亡检测公司提醒：悬浮细胞直接离心即可）；
2、清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；
3、分组：每一次实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和Annexin V双染组，处理组按从低到高进行双染；
4、染色：用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬，（这里重点提醒，要在避光条件下加入染料）。不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V 和PI各5μL，并用移液枪轻轻混匀；
5、上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。
根据细胞凋亡检测多年实验经验，大家在进行流式检测细胞凋亡时，这几个问题一定要注意：
1、收集细胞时力度不要过大，力度过大很可能造成细胞膜损伤，导致细胞膜的磷脂层暴露，从而结合Annexin V，导致假阳性，因此处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。
2、染色后1h内一定要上机检测，由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。
3、避光条件下加入染料，Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光（这一点在前面实验操作步骤中也有重点提醒，一定要注意哦）；
